Обнаружение одиночных молекул, освещаемых светоизлучающим диодом

1. Аннотация Оптическое обнаружение и спектроскопия отдельных молекул стало незаменимым инструментом...
2. 2. Материал и методы.
3. 3. Результаты и обсуждения
4. 3.2. Измерение минимальной освещенности для обнаружения одиночной молекулы
5. 3.3. Обнаружение одиночных сигналов молекулы
6. 4. Перспектива

Аннотация

Оптическое обнаружение и спектроскопия отдельных молекул стало незаменимым инструментом в биологической визуализации и зондировании. Его успех основан на флуоресценции молекул органических красителей при тщательно спроектированном лазерном освещении. В этой статье мы демонстрируем оптическое обнаружение отдельных молекул на широкоугольном микроскопе с подсветкой на основе имеющегося в продаже зеленого светодиода. Результаты напрямую сравниваются с лазерным освещением в той же экспериментальной конфигурации. Обсуждаются установка и ограничивающие факторы, такие как перенос света на образец, спектральная фильтрация и результирующее отношение сигнал / шум. Представлен теоретический и экспериментальный подход к оценке этих параметров. Результаты могут быть адаптированы к другим схемам одиночного излучателя и освещения.

Ключевые слова: одиночные молекулы, флуоресцентная микроскопия, светодиод, светодиод, отношение сигнал / шум, детектирование одиночного фотона.

1. Введение

Изобретение лазера в 1960-х годах стало ключевой эволюцией на пути к оптическому обнаружению одной молекулы. Уже в 1976 году Х. Иршфельд провел эксперимент, который стал важным шагом на пути к этой цели [ 1 ]. Используя лазер для возбуждения флуоресцентно легированного образца и детектируя спектрально отфильтрованный свет на фотоумножителе, он смог увидеть флуоресцентный отпечаток кластера молекул. В 1980-х годах Мёрнер и К адор успешно провели первое оптическое обнаружение одиночных молекул пентацена [ 2 ], но эта новая техника стала важной для биологии и зондирования только в 1990-х годах, когда эксперименты были распространены на работу при комнатной температуре. Эти эксперименты основаны на эффективном выделении лазерного излучения возбуждения от красной смещенной флуоресценции молекулы [ 3 ]. С тех пор спектроскопия одиночных молекул стала ценным инструментом для преодоления усреднения по ансамблю по многим излучателям и для проведения микроскопии в ограниченном субдифракционном масштабе [ 4 , 5 ]. С точки зрения чувствительности обнаружение отдельной молекулы определенного соединения представляет собой предельный предел.

Вышеуказанные эксперименты проводились с использованием лазерного освещения. Узкая ширина линии и когерентная природа лазерного излучения обеспечивают спектральную дискриминацию и легкую фокусировку. Эксперименты, выполненные с использованием других источников света для исследования одной молекулы, редки [ 6 - 8 ]. В других областях, например, при визуализации белого света или флуоресцентной микроскопии, использование не лазерных источников хорошо установлено. В настоящее время одним из наиболее интересных источников света для микроскопии является светодиод (LED), который в последние два десятилетия претерпел значительные инженерные усилия. Мощные светодиоды имеются в продаже и могут рассматриваться как компактные и недорогие источники для обнаружения и обнаружения одиночных молекул или даже для генерации одиночных фотонов. Их доступность в спектральном диапазоне от 280 до 1300 нм, стабильный выход, их электрическая нечувствительность и длительный срок службы делают их привлекательными альтернативами лазерным диодам для некоторых применений.

В этой статье мы обсуждаем использование коммерчески доступного светодиода в качестве источника возбуждения для исследований с одной молекулой. В отличие от представленного ранее [ 7 , 8 ], мы расширяем эксперименты до зеленой части видимого спектра. Минимальное излучение для возбуждения и обнаружения отдельных молекул оценивается путем сравнения ожидаемых уровней освещенности с номинальной чувствительностью камеры и однофотонных детекторов. Строгое доказательство того, что одна молекула была обнаружена, возможно только при обнаружении характерной антисгруппированной статистики фотонов [ 9 ]. Обсуждаются перспективы генерации и обнаружения одиночных фотонов на основе светодиодной подсветки. Экспериментально мы сравниваем светодиоды и схемы лазерного возбуждения бок о бок. Показано, что отдельные молекулы могут быть отображены с помощью светодиодной подсветки и представлены факторы влияния. Это расширяет работу K uo и сотрудников, в которых упоминаются настоящие экспериментальные результаты по обнаружению одиночных молекул в синей части спектра [ 7 ].

2. Материал и методы.

Образец для всех дальнейших экспериментов и оценок состоит из легированной тонкой кристаллической пленки п- терфенила (Aldrich), нанесенной методом центрифугирования на покровное стекло микроскопа [ 10 ]. В качестве легирующей примеси была выбрана хорошо охарактеризованная флуоресцентная молекула террилена [ 11 , 12 ]. Концентрация молекул тририлена (исследования ПАУ) составляет порядка 10-10, чтобы обеспечить пространственное разделение. На площади 10 × 10 мкм 2 наблюдалось 1–20 молекул. Покровные стекла очищали органическими растворителями в ультразвуковой ванне, а затем переносили в раствор из 1 части серной кислоты и 3 частей перекиси водорода (раствор пиранья) для очистки органических остатков. Покровные стекла продолжают погружаться в раствор для хранения до использования и ополаскиваются под водой перед приготовлением прядильного покрытия.

Все наши исследования с одной молекулой были выполнены на изготовленном на заказ инвертированном микроскопе, который можно настроить для широкоугольного или конфокального изображения и использовать светодиодную или лазерную подсветку в любой конфигурации (). В качестве хорошо охарактеризованного источника света Nd: YAG-лазер с удвоенной частотой (532 нм) был подключен к пути возбуждения через одномодовое оптическое волокно. Чтобы разрешить микроскопию в режиме широкого поля, линза af = 300 мм была размещена на оптическом пути, чтобы сфокусировать свет в заднюю фокальную плоскость объектива микроскопа и создать гауссовидную освещенную область на образце (полная ширина, половина максимума, FWHM ≈ 8 мкм ). Освещение и обнаружение выполняли с помощью объектива 100 ×, 1,4 NA (Olympus, UPlanSApo). Обнаружение в режиме широкого поля осуществлялось недорогой коммерческой астрономической камерой (Watec, Wat-120N +, CCD: SONY ICX-419ALL). Изображение было снято объективом 200 мм (AF Nikkor). Один пиксель на камере соответствует ширине стандартного отклонения пятна, ограниченного дифракцией (σ120 нм) на образце, при условии, что пятно, ограниченное дифракцией, показывает FWHM ≈300 нм. Таким образом, отношение пикселя к размеру пятна равно 1, как определено в [ 13 ], что является оптимальным для локализации отдельных молекул. Для записи изображений использовалась видеокарта с разрешением оцифровки номиналом 8 бит. Время интегрирования камеры может быть установлено на максимальное значение 10,24 с.

Экспериментальная установка, состоящая из конфокального микроскопа (детекция не показана) с конфигурацией широкого поля. Откидное зеркало позволяет переключаться между лазерной и светодиодной подсветкой. Врезка: светодиодная сборка с двумя линзами, светодиод монтируется с термопастой непосредственно на трехступенчатый термоэлектрический охладитель (TEC), который крепится к радиатору с вентиляторным охлаждением.

Для экспериментов с использованием светодиода на пути освещения было введено откидное зеркало, так что либо лазер, либо светодиодный свет проходил к образцу, в то время как путь обнаружения оставался неизменным. Это позволяет сравнивать результаты на основе светодиодов с хорошо охарактеризованными результатами лазерного освещения. Для лазерного освещения обнаружение выполнялось в конфокальной и широкоугольной конфигурации, тогда как для светодиодного освещения регистрировались только широкоформатные изображения.

Выбор источника светодиодного освещения основывался на спектральном перекрытии с поглощением трилена. Поэтому были оценены коммерчески доступные зеленые светодиоды с центральной длиной волны около 535 нм. Для дальнейших экспериментов был выбран тот, который имел наибольшую интенсивность освещения (Luminleds Luxeon Rebel, LXML-PM01-0080, InGaN). С поверхности матрицы 1,6 × 1,6 мм2 оптическая мощность 240 мВт при номинальном максимальном токе 700 мА была обнаружена на измерителе оптической мощности, размещенном непосредственно перед диодом. Ток можно увеличить до 1,6 А, что приведет к Pout = 300 мВт (≈180 лм) при надлежащем охлаждении и уменьшении срока службы устройства. Световой выход в этом высоком диапазоне мощностей составляет около 5%. На поверхности матрицы излучаемая мощность соответствует выходу 120 кВт / м2. Сдвиг длины волны во всем диапазоне токов составлял менее 5 нм от пиковой длины волны λ = 530 нм (см.). Спектральный выход излучения M = 530 нм составляет 3000 Вт / (м2 нм).

Измеренное излучение света непосредственно перед светодиодом, установленным в диодной сборке. Пунктирная линия показывает номинальный максимальный ток 700 мА.

Спектр поглощения террилена и спектр излучения нефильтрованного светодиода. Пунктирная линия представляет длину волны Nd: YAG-лазера с удвоенной частотой. Излучение одного на другое показывает на 40% большее значение для светодиодной подсветки. Большее спектральное перекрытие обеспечивает более эффективное возбуждение. Вставка: Террилен (слева) и матричная молекула п- терфенила (справа).

Тепловое управление светодиодами высокой мощности играет важную роль в течение всего срока службы устройства. В отличие от ссылки [ 7 , 8 ] мы используем светодиоды в зеленой области спектра. Зеленые светодиоды имеют наименьшую светоотдачу светодиодов в видимом спектре, тогда как ранее описанные [ 7 , 8 ] синие / ультрафиолетовые светодиоды имеют КПД до 20% [ 14 ]. Наши представленные эксперименты требуют гораздо более тщательного охлаждения светодиодов, но также могут быть распространены на красители, которые в настоящее время более актуальны для биологической визуализации, такие как Cy3, Cy5 и другие Alexa-красители в красной области спектра. Для обеспечения расширенного источника питания для светодиода был использован трехступенчатый термоэлектрический охладитель (Ferrotec, 9530/119/045 B) для охлаждения основания светодиода до температуры ниже 0 ° C. В рабочих условиях конденсация тормозилась из-за более высокой тепловой нагрузки на светодиод.

Спектральная фильтрация на пути возбуждения проводилась с помощью полосового фильтра 500–580 нм, прикрепленного непосредственно к сборке светодиода (Photonik, Singapore,). Этот фильтр был необходим для подавления более длинных составляющих излучения светодиодов, которые просачивались через фильтр обнаружения. Интегральная пропускание светодиода через полосовой фильтр составило 70%.

Путь обнаружения был снабжен дихроичным (50% пропускание / отражение при 567 нм, Thorlabs DMLP 567) и длиннопроходным фильтром с номинальной длиной волны отсечки 640 нм (Omega Optical 640AELP). Последний был наклонен, чтобы соответствовать отрезанной длине волны возбудителя (см. Пропускание наклонного фильтра). Угол был настроен путем наблюдения изображений с камеры на минимальное фоновое свечение. Использование дихроичного зеркала также уменьшает пропускание света возбуждения к детектору; должна быть достаточна дополнительная пара длиннопроходных и короткопроходных фильтров, с длинноходовым фильтром на детекторе и короткочастотным фильтром на источнике света.

Спектр излучения молекул тририлена. Оптимальная спектральная фильтрация использует аналогичный наклон к спектру излучения молекулы. В нашей экспериментальной конфигурации наклонный фильтр был наклонен, чтобы соответствовать фильтру возбуждения с падающим наклоном около 585 нм.

Оптимальная схема спектральной фильтрации важна для различия между возбуждающим светом и обнаруженной флуоресценцией, таким образом максимизируя отношение сигнала к фону. В идеале фильтры должны передавать весь возбуждающий свет на образец и одновременно передавать всю полученную флуоресценцию на детектор. Одновременно эти фильтры должны блокировать свет возбуждения, рассеянный от образца на пути обнаружения. Если набор фильтров коротких проходов / длинных проходов имеет дополнительные ступенчатые спектры пропускания вокруг среза длины волны отсечки λ , и позаботится о подавлении обратного рассеянного света возбуждения, можно оптимизировать сигнал от молекулы, варьируя длину волны отсечки для широкополосных источников, таких как светодиоды. Для этого мы объединяем спектральную плотность мощности источника l ( λ ), пропускание f exc ( λ ) через все фильтры возбуждения и нормализованный спектр поглощения a ( λ ) молекулы с эффективным потоком возбуждения ϕ возбуждения путем интегрирования на всех длинах волн возбуждения λe :

Оказывается, что нормализованный поток возбуждения для нашего светодиода примерно на 40% больше, чем для лазера при 532 нм из-за лучшего спектрального соответствия.

Если предположить, что спектр флуоресценции не зависит от его спектра возбуждения, что имеет место для простой конфигурации оптической флуоресценции, то обнаруженная мощность пропорциональна произведению этого потока возбуждения. Реакция пути обнаружения ϕ обнаружения объединяет спектр излучения e ( λ ) молекулы, нормализованный до e = 1 в максимуме, передачу f det ( λ ) через все фильтры обнаружения и реакцию детектора r ( λ ) для всего обнаружения длины волны λd :

Для комбинации спектров излучения / поглощения светодиода и террилена в нашем эксперименте (см. И) значение λ cut = 565 нм максимизирует продукт ϕ возбуждения · ϕ обнаружения и, следовательно, сигнал обнаружения.

Одним из основных преимуществ когерентного освещения является конструктивная интерференция в (лазерном) фокусе, достигающая максимальной интенсивности света для эффективного возбуждения молекулы. Лазерный свет можно сфокусировать до размера, приблизительно равного половине длины волны ( λ / 2), что невозможно для светодиодного света. Ограниченная фазово-пространственная плотность некогерентного света приводит к увеличению площади освещения и, соответственно, снижению освещенности. Обычные светодиоды имеют L-янтарный профиль пространственного излучения и оснащены твердой иммерсионной средой, состоящей из поликарбоната, акрилового стекла или, как в используемом светодиоде, силиконового каучука для устройств большой мощности. Это эффективно увеличивает излучение света из матрицы и концентрирует свет в прямом направлении. В зависимости от точности изготовления матрицы и погружной среды профиль эмиссии может значительно различаться. Чтобы адаптировать характеристики излучения светодиода к геометрии изображения объектива микроскопа, необходима дальнейшая коллимация. В наших экспериментах очень близкая к светодиоду выходная линза с высоким значением NA (Geltech, C330TME-A, f = 3,1 мм, 0,68 NA). Для этих комбинаций объектив / светодиод твердотельный иммерсионный узел ограничивал минимальное расстояние фокусировки, таким образом, ограничивая эффективную разводку NA. Расчетное излучение в одном полушарии составляет 20 кВт / м2 с.с. при мощности 300 мВт, приходящейся на площадь 1,6 × 1,6 мм2. При наличии асферической линзы и предполагаемом эффективном NA, равном 0,5, мы ожидаем высокую эффективность отвода, равную 80%, если излучаемый профиль является чисто янтарным. Измеренная мощность за асферической линзой составляет 25% от максимальной измеренной мощности системы прямо за поверхностью кристалла светодиода, что указывает на отклонение профиля интенсивности Ламберта и эффективный более низкий NA. С этими значениями мы рассчитываем сияние 30 кВт / м2ср. Предполагая угол фокусировки на образце 3,9 ср (1,4 нА), это соответствует максимальной освещенности 120 кВт / м2 на поверхности образца. Асферическую линзу с выходным соединением использовали в сочетании с ахроматической линзой 50 мм для направления испускаемого света в прямом направлении. Измеренное эквивалентное фокусное расстояние системы составило 10 мм.

Из-за конечного расширения светодиодной матрицы и некогерентного излучения света, луч не может быть полностью коллимирован. Первоначальные попытки фильтровать моды, использующие одномодовое волокно, приводили к выходной мощности в диапазоне nW и не преследовались в дальнейшем, так что пришлось использовать широкополосное освещение. Для обеспечения оптимального перемещения к образцу и уменьшения отсечения светодиодная сборка располагалась в непосредственной близости от установки микроскопии. Первоначально матрица была отображена на заднюю фокальную плоскость объектива микроскопа, чтобы уменьшить отсечение оптического пути. Эта конфигурация привела к размытой матрице, изображенной на образце, и показала более низкую интенсивность в фокальной плоскости, независимо измеренную с помощью флуоресцентных шариков. Для более поздних экспериментов матрица была сфокусирована на покровном стекле, так что ее структура была видна на широкоугольной камере, если были удалены спектральные фильтры.

3. Результаты и обсуждения

3.1. Оценка минимальной освещенности для обнаружения одиночных молекул

В качестве первого подхода к оценке минимального излучения, необходимого для обнаружения отдельных молекул, которые освещаются светодиодом, мы вводим выражение переноса. Это связывает падающий свет с обнаруженным результатом и сравнивает его с чувствительностью и уровнями шума в системе. Взаимодействие света с одним излучателем определяется эффективным сечением поглощения излучателя и освещенностью в этой области, т. Е. Эффективной напряженностью поля в месте расположения излучателя и вероятностью возбуждения. Сечение экстинкции одной молекулы имеет порядок σ abs ≈ 1 × 10−15 см2 [ 12 , 15 ]. При плотной фокусировке света до пятна, ограниченного дифракцией, диаметром ≈300 нм, мы получаем эффективное перекрытие σ eff 1,5 × 10–6, т.е. только один фотон из 106 возбуждает молекулу, тогда как оставшийся свет не взаимодействует или имеет возможность взаимодействовать с окружающей средой, что приводит к нежелательному фону. В зависимости от квантового выхода флуоресценции Φfl и коэффициента ветвления молекулы α ветвление, только часть поглощенных фотонов приводит к смещенному красным излучением, которое позже обнаруживается. Интегральная эффективность детектирования η det для обычных конфокальных микроскопов обычно оценивается в 1–5% и может быть описана следующими терминами: Геометрический датчик η geo определяется главным образом числовой апертурой объектива микроскопа. В нашей экспериментальной конфигурации с объективом 1.4 NA мы покрываем половину угла 67 °, что соответствует 30% всего излучения за 4 π . Мы регистрируем свет в диапазоне 590–700 нм, так что 45% спектрального излучения передается на детектор ( η spec). Все фильтры на пути обнаружения были измерены, чтобы иметь интегральную пропускную способность лучше, чем 85% ( η фильтра). Наконец, квантовая эффективность нашего детектора η qe находится в нашем диапазоне обнаружения (590–700 нм) между 55% ​​и 35%, тогда как большая часть света излучается на более длинных волнах. Это приводит к эффективному квантовому выходу детектора 50%.

Предполагая изотропное излучение, детектируемая мощность P det от молекулы имеет вид

с

Мы предполагаем, что квантовый выход молекулы Φfl равен 0,7 [ 16 ] и эффективность обнаружения η det 5%. Отношение ветвления между смещенными красным и резонансно рассеянными фотонами принимается равным 1, потому что мы возбуждаемся на более высокий уровень колебаний и рассматриваем все излучение из первого электронного возбужденного состояния. Отсюда следует, что для наблюдения потока 800 детектируемых фотонов / с на ПЗС-камере требуется частота падения 1,5 × 1010 фотонов / с (что соответствует 80 кВт / м2) на сечение поглощения. Теперь мы свяжем эту скорость с чувствительностью обнаружения камеры:

Минимальная освещенность камеры составляет 2 × 10–5 лк, что соответствует ≈40 фотонов на пиксель и секунду в спектральном диапазоне детектирования 590–700 нм. Измеренная эквивалентная по шуму мощность с временем интегрирования 10,24 с составила 36 фотонов на пиксель. Молекула испускает 15000 фотонов в секунду, из которых 800 детектируется в секунду, происходящих из пятна, ограниченного дифракцией, которое отображается так, что в среднем 20% его детектируемого излучения отображается на одном пикселе. Это обеспечивает освещенность ≈8 × 10–5 люкс или 160 фотонов на пиксель и секунду, что в четыре раза превышает номинальную минимальную чувствительность камеры.

Показателем качества во всех экспериментах является отношение сигнал / шум, которое позволяет различать реальный сигнал и фоновый шум. Должны быть включены источники собственного шума, такие как шум фотонных импульсов, шум темного счета и фоновый шум.

При тех же уровнях освещенности, что и упомянутые выше, мы имеем уровень шума при выстрелах 800 фотонов / с. Это значение может быть напрямую сопоставлено с уровнем шума однофотонного детектора, такого как лавинный фотодиод (APD). Заданное минимальное освещение камеры должно включать в себя собственное отношение сигнал / шум и уже охватывается нашими предположениями о чувствительности выше. Блокируя падающий свет на камеру и по-прежнему обеспечивая линейность во всем диапазоне обнаружения, мы обнаруживаем фоновый уровень 13%, что соответствует 270 темным отсчетам в секунду на одном фотонном детекторе. Измеренный среднеквадратичный шум в 2% соответствует 36 фотонам в секунду. Это значение примерно в два раза выше ограниченного значения дробового шума в 270 фотонов. Интересно, что уровень фона со светодиодной подсветкой в ​​3–4 раза выше, чем фон камеры, из-за несовершенства спектральной фильтрации. Так как мы можем чередовать два варианта освещения, мы можем исключить этот эффект, который возникает исключительно из-за фоновой флуоресценции образца. Собственный уровень шума камеры не позволяет связать увеличение уровня шума из-за увеличенного фона и существенно не изменяется в пределах диапазона обнаружения.

3.2. Измерение минимальной освещенности для обнаружения одиночной молекулы

Чтобы экспериментально определить минимальные уровни освещенности при светодиодном возбуждении, мы выполнили лазерную широкополосную визуализацию и определили минимальное количество излучения, необходимое для наблюдения отдельных молекул на камере. В этих экспериментах время интегрирования камеры (10,24 с) и усиление были увеличены до максимума, а мощность лазера была впоследствии уменьшена. При пороге лазерного излучения 80 кВт / м2 отдельные молекулы все еще можно было наблюдать на камере без какой-либо постобработки изображения. Излучение светодиода имеет номинально одинаковое значение, и с учетом лучшего спектрального перекрытия на 40% этого значения должно быть достаточно для формирования изображения.

Перед проведением наблюдений с использованием светодиодной подсветки пространственные положения отдельных молекул определяются с помощью широкоугольного лазерного освещения с достаточно высокой освещенностью. При уровнях освещенности около 80 кВт / м2 мерцание флуоресценции не наблюдается из-за длительного времени интегрирования, тогда как одностадийное обесцвечивание от кадра к кадру сильно указывает на обнаружение сигналов одной молекулы. После этого путь возбуждения был изменен, и чередующиеся изображения были записаны с лазерной и светодиодной подсветкой. Пример представлен в. Изображения не обрабатываются, а отображается только часть динамического диапазона. Мы определили, что лазерное широкополосное освещение находится на гауссовой области с шириной FWHM ≈8 мкм . В центре интенсивность излучения составляет около 80 кВт / м2, и молекулы все еще наблюдаются при более низких интенсивностях на этих изображениях с использованием меньшего динамического диапазона. Эффективный размер пикселя увеличивается картой захвата кадра до ≈200 нм на пиксель. В измеренных характеристиках микроскопа мы достигаем несколько больших размеров, как ожидается для дифракционной микроскопии. Для светодиодного освещения мы достигаем FWHM 330 нм, тогда как лазерное освещение приводит к FWHM 430 нм. Мы приписываем это отклонение механическому дрейфу.

Прямое сравнение двух широкоугольных изображений, полученных с помощью лазера (а) и светодиодной подсветки (б) . Уровни серого на изображениях были адаптированы для учета увеличенного фона со светодиодной подсветкой. Тем не менее, более слабое отношение сигнал / шум очевидно. Для прямого сравнения уровни камеры представлены без поправок на рисунке (с) . Уровень фона камеры составляет 13% (блокирует свет возбуждения) и должен быть вычтен для обоих освещений. Утечка света через фильтры увеличивает фоновую освещенность светодиодов более чем на 60%.

Не было внесено никаких исправлений и показан полный диапазон камеры. Для лазерного освещения мы наблюдаем широкополосную освещаемую область и плоский фон подсветки для светодиодного освещения. Гауссова огибающая интенсивности при лазерном возбуждении соответствует широкопольному пятну, генерируемому линзой на пути падающего луча.

Для лазера и светодиодного освещения мы заметили значительный фоновый вклад, обусловленный остаточной флуоресценцией п- терфенила. Здесь мы подчеркиваем, что прямое сравнение двух методов освещения позволяет судить о качестве образца и отличать его от спектральной утечки через фильтры возбуждения. В наших экспериментальных результатах оба параметра не являются пренебрежимо малыми и приводят к увеличению интенсивности фона в два раза (см.).

3.3. Обнаружение одиночных сигналов молекулы

Находясь на нижнем пределе интенсивности возбуждения, нам удалось обнаружить одиночные молекулы со светодиодной подсветкой в ​​режиме широкого поля с отношением сигнал / шум 3,5. Соответствующее отношение сигнал / шум, создаваемое лазерным освещением, составляло 19. Соотношение сигнал / фон составляет 0,12 и 1 соответственно. Чтобы определить наличие объекта, критерий Розы в изображении предлагает отношение сигнал / шум выше 5 [ 17 ], который не указан в нашей конфигурации со светодиодной подсветкой. Тем не менее, благодаря дополнительным знаниям об излучателе, а именно о его нанометровом размере, что приводит к образованию пятна, ограниченного дифракцией, мы можем определить отдельные молекулы по уровню шума нашей схемы обнаружения. Как обычно, широкополосное обнаружение позволяет нам использовать алгоритм локализации для пространственной локализации отдельных излучателей с субдифракционной точностью. Для образцов с более высоким легированием флуоресцентных молекул критерий Розы действительно ограничил бы вероятность определения сигналов одной молекулы.

4. Перспектива

Двойная широкоугольная / конфокальная конфигурация этого прибора оптимизирована для быстрой локализации отдельных излучателей и последующей конфокальной визуализации и измерения отдельных молекул. Мы показали, что текущая установка способна надежно идентифицировать отдельные молекулы как с лазерными, так и с светодиодными источниками освещения. Чтобы строго доказать наличие одного излучателя, необходимо обнаружить однофотонное излучение. Поэтому функция автокорреляции фотон-фотон для нулевой временной задержки, g (2) (0), будет тогда ниже 0,5 [ 18 ]. Однако из представленных выше изображений на основе светодиодов становится ясно, что это пока невозможно. Присутствие других молекул или фонового света вводит дополнительные фотоны, аналогично наличию большего количества излучателей с определенной вероятностью обнаружения в месте наблюдения. Автокорреляционная функция для нулевой временной задержки может быть выражена как g (2) (0) = 1 - 1 / (1 + i = 1 n η i, det P i), где n - количество дополнительных излучателей. Отношение сигнал / фон (SBR) будет определяться как SBR = 1 / (∑ i = 1 n η i, det P i), так что окончательное уравнение имеет вид g (2) (0) = 1 / (1 + SBR ). При использовании более высокой интенсивности лазера при нескольких сотнях кВт / м2 в конфокальной конфигурации мы смогли быстро получить сигналы автокорреляции со значениями ниже g (2) (0) = 0,2, что доказало работоспособность образца. В случае светодиодной подсветки и отношения сигнал / фон 0,12 невозможно получить автокорреляционную функцию ниже g (2) (0) ≈ 0,89. Шум и фоновый уровень должны быть снижены в 9 раз, чтобы падение в g (2) (0) упало ниже 0,5 по мере необходимости. Эту проблему можно обойти, используя кварцевые покровные стекла для уменьшения фона флуоресценции и оптимизированный набор фильтров с длиной волны отсечки 565 нм. Другой подход состоит в том, чтобы более эффективно пространственно фильтровать излучаемый свет, например, при конфокальной визуализации или захватывать свет в одномодовом волокне. В дальнейших исследованиях нам не удалось обнаружить отдельные молекулы со светодиодной подсветкой в конфокальной конфигурации. Пространственная фильтрация по одномодовым волокнам слишком резко снизила эффективную эффективность, о чем также сообщали другие группы [ 8 ].

Для достижения триггерного однофотонного излучения следует использовать ширину оптического импульса ниже времени T1 молекулы, т. Е. Несколько нс. Такие светодиоды в настоящее время доступны на рынке (например, Picoquant, серия PLS), но их освещенность значительно меньше, чем те, которые используются в этой статье. Благодаря используемому здесь светодиоду мы смогли генерировать короткие импульсы до 100 нс. Индуктивность связующих проводов может быть ограничивающим фактором в сокращении импульса для нашего устройства, но это не было дополнительно изучено.